Vasco Núñez de Balboa descubrió el Mar del Sur el 25 de septiembre de 1513, y desde entonces el Pacífico empieza a tomar importancia. El 15 de agosto de 1519 el gobernador Pedrarias funda la primera ciudad del pacífico sobre un villorrio de nativos conservando el nombre original: PANAMÁ (abundancia de peces y mariposas), pero dándole oficialmente el nombre de “Nuestra Señora de la Asunción de Panamá”. El Obispo Fray Juan de Quevedo viajó a España para asuntos relacionados con la nueva colonia y acusó ante el Rey Carlos V a Pedrarias por el mal trato dado a los indios; este Pastor fue víctima de una epidemia y muerte cerca de Barcelona, en Molins del Rey, el 24 de diciembre de 1519.

La ciudad de Panamá toma cada día, mayor importancia pues es puerto necesario para el descubrimiento y colonización de Sur América especialmente el Imperio Inca.

El segundo Obispo de Santa María fue el dominico Fray Vicente Peraza nombrado en 1521 y consagrado en Burgos. Llegó a la Diócesis en 1524 y por disposición del gobernador Pedrarias trasladó a la ciudad de Panamá la sede episcopal conjuntamente con las autoridades civiles.

El traslado de la Sede Episcopal de Santa María a la ciudad de Panamá no significó la desaparición de esa Iglesia sino mudanza del Obispado, de la catedral y del Cabildo. La provincia de Castilla de Oro tampoco desapareció el trasladarse las autoridades a la nueva ciudad del Pacífico. Este Obispo fallece algunos meses después de su llegada a Panamá y circuló el rumor de que fue envenenado por orden del gobernador Pedrarias. La Diócesis quedó vacante por espacio de diez años. Llega después el tercer Obispo Fray Tomás de Berlanga en 1534 quien era provincial de los Padres Dominicos en Santo Domingo y fue el primero en insinuar al Rey Carlos V la construcción de un canal para unir los dos mares. Correspondió a este Obispo iniciar los trabajos de la catedral cuya torre se mantiene en pie y es símbolo elocuente no sólo de la Iglesia sino también de la fe del pueblo panameño. Diez años después Tomás de Berlanga renunció a su cargo y7 regresó a España.

Durante varios años los Obispos si bien residían en Panamá firmaban: “Obispo de Santa María”, “Obispo de Castilla de Oro”, Obispo de tierra firme” y hasta “Obispo del darién”; finalmente “Obispo de Panamá”, ya que la ciudad sede da el nombre a la Diócesis.

Siendo Sancho Pardo de Cárdenas, Obispo de Panamá, la ciudad fue saqueada e incendiada por el pirata inglés Enrique Morgan el 28 de enero de 1671.